含酪氨酸硫酸化修饰的芋螺毒素的高效合成方法及表征

李长鹏

华南理工大学

DOI：   10.27151/d.cnki.ghnlu.2020.004589

摘要：蛋白质酪氨酸硫酸化(Sulfotyrosine,sY)是一种普遍存在于生物体内的翻译后修饰。多数硫酸化蛋白质会参与蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein interaction,PPI)从而影响生理功能如止血、白细胞黏附等,其中有部分PPI过程是通过识别酪氨酸上的硫酸根来参与,因此,sY与蛋白生物活性的关系备受关注。当前较普遍采用的策略是通过新戊基(Neopentyl,nP)来对硫酸根进行保护从而防止其在多肽合成中水解,但目前合成的多数硫酸化多肽其序列不含半胱氨酸(Cys)残基,这与其侧链巯基在nP脱除条件下不稳定有关。然而,Cys存在于多数重要生理蛋白/多肽中,因此有必要开发一种更为普适的、含半胱氨酸的硫酸化修饰多肽合成方法来推动相关多肽/蛋白药物的基础研究。芋螺毒素被誉为“海洋药物宝库”,其药用活性已经成为当今国际生物医药领域研究的热点之一。α4/7-芋螺毒素一般由15-22个氨基酸组成且包含4个Cys,因其能特异性阻断神经型乙酰胆碱受体而被认为是极具潜力的神经性疾病药物。此前有研究人员通过质谱手段发现部分α4/7-芋螺毒素存在sY修饰,但由于难以获取均一硫酸化多肽而导致其活性及相关研究并未能顺利开展。在本论文工作中,我们对sY的保护基nP的脱除方法进行了一系列探索,最终得到了其保护基脱除的一般性规律,认为nP在大多数水溶液中均可脱除。我们将该方法应用于8条硫酸化α4/7-芋螺毒素的合成:通过Fmoc-SPPS策略制备得到线性多肽,以分步、选择性的方法对多肽进行定向折叠,在折叠的同时完成nP基团的脱除,实现一锅法高效制备含sY的目标多肽。并且,我们也成功避免了硫酸根在酸性条件下的水解问题,最终利用常规HPLC制备得到含sY修饰的芋螺毒素。通过动物血清实验表明了多肽在血清中具有良好的稳定性且sY修饰不会降低多肽的稳定性。最后,为了探究sY修饰对于芋螺毒素与乙酰胆碱结合蛋白相互作用的影响,我们对乙酰胆碱结合蛋白的重组表达进行了初试,但发现该蛋白在透析复性以及蛋白酶切过程中极易多聚且不可控。总的来说,我们开发了一种高效的含半胱氨酸的硫酸化多肽的合成方法来推动硫酸化多肽/蛋白的合成研究,并为硫酸化修饰多肽/蛋白的药用机理研究打下坚实的基础。 

关键词：      酪氨酸硫酸化修饰;多肽合成;多肽折叠;新戊基的脱除;芋螺毒素;乙酰胆碱结合蛋白;

专辑：   工程科技Ⅰ辑

专题：   有机化工

DOI：   10.27151/d.cnki.ghnlu.2020.004589

分类号：      TQ464

导师：   何春茂;

学科专业：   分析化学

硕士电子期刊出版信息： 年期：2021年第02期网络出版时间：2021-01-16——2021-02-15

 含酪氨酸硫酸化修饰的芋螺毒素的高效合成方法及表征|李长鹏|华南理工大学

 酪氨酸硫酸化修饰|多肽合成|多肽折叠|新戊基的脱除|芋螺毒素|乙酰胆碱结合蛋白

 

文章目录
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 引言
    1.2 芋螺毒素
        1.2.1 芋螺毒素的折叠研究
        1.2.2 芋螺毒素类似物和突变体研究
        1.2.3 α4/7-芋螺毒素与硫酸化酪氨酸
    1.3 乙酰胆碱结合蛋白
    1.4 酪氨酸硫酸化(sY)修饰
        1.4.1 酪氨酸硫酸化修饰的生理学作用
        1.4.2 酪氨酸硫酸化修饰的检测和预测
        1.4.3 含硫酸化的蛋白质/多肽的制备方法
    1.5 固相多肽合成(SPPS)
        1.5.1 SPPS策略
        1.5.2 SPPS试剂以及纯化方法的选择
    1.6 本文的研究内容与研究意义
        1.6.1 研究内容
        1.6.2 研究意义
第二章 Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH的合成以及脱保护
    2.1 引言
    2.2 实验部分
        2.2.1 实验原料
        2.2.2 实验仪器
        2.2.3 Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH的合成
        2.2.4 nP保护基脱除条件筛选
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH合成表征
        2.3.2 保护基脱除结果
    2.4 本章小结
第三章 α4/7-芋螺毒素的化学合成
    3.1 引言
    3.2 实验部分
        3.2.1 实验原料
        3.2.2 实验仪器
        3.2.3 不含sY芋螺毒素的合成以及折叠
        3.2.4 含sY芋螺毒素的合成以及折叠
        3.2.5 血清稳定性实验
        3.2.6 多肽分离和富集纯化
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 合成方法的探究
        3.3.2 α4/7-芋螺毒素的合成与折叠
        3.3.3 圆二色光谱
        3.3.4 芋螺毒素血清稳定性
    3.4 本章小结
第四章 乙酰胆碱结合蛋白表达方法的探究
    4.1 引言
    4.2 实验部分
        4.2.1 实验原料
        4.2.2 实验仪器
        4.2.3 His6-SUMO-Ac-ACh BP的包涵体表达
        4.2.4 蛋白质复性和酶切条件的探究
        4.2.5 蛋白质分析与纯化方法
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 培养及诱导表达条件筛选
        4.3.2 复性,酶切以及纯化
    4.4 本章小结
结论与展望
参考文献
攻读硕士学位期间取得的研究成果
致谢
附件

含酪氨酸硫酸化修饰的芋螺毒素的高效合成方法及表征|李长鹏|华南理工大学

 酪氨酸硫酸化修饰|多肽合成|多肽折叠|新戊基的脱除|芋螺毒素|乙酰胆碱结合蛋白